NGFN-PLUS
Validierung und Zergliederung der Signalwege von krankheitsrelevanten Genen mit endoribonuklease-präparierter siRNA
Leitung: | Prof. Dr. Frank Buchholz | |
Institut: | Medizinische Fakultät der TU Dresden, Universitäts Krebszentrum (UCC), Universitätsklinikum Carl Gustav Carus | |
Homepage: | http://www.buchholzlab.org |
Ziel des Projektes war es, funktionale Daten hinsichtlich Protein-Protein-Interaktionen via Funktionsverluststudien zu erzielen. Mit Hilfe der in unserem Labor entwickelten hoch effizienten und spezifischen endoribonuklease präparierten (e)siRNA Ressourcen wurden Knockdowns (Ausschaltungen) von Proteinkandidaten durchgeführt, um Protein-Komplex-Zusammensetzungen zu bestimmen, als auch Proteinlandschaften umfassend zu studieren. Unter dem Einsatz von esiRNA-basierten RNAi-Screens konnten zahlreiche neue krankheitsrelevante Gene identifiziert werden. So konnte ein neuartiger Protein-Komplex, welcher im Zusammenhang mit der Erkrankung Hereditäre Spastische Spinalparalyse (HSP) steht, identifiziert und funktionale Beziehungen zwischen HSP-Erkrankungen und DNA-Reparatur bestimmt werden. Darüber hinaus wurde ein vergleichender RNAi Screen in TP53 positiven und TP53 negativen Zellen erfolgreich durchgeführt. Hierbei wurde u.a. das Gen UNRIP als Vulnerabilität (Verletzlichkeit) von TP53-negativen Krebszellen aufgedeckt. Da TP53 eines der am häufigsten mutierten Gene bei Krebserkrankungen ist, enthüllt diese Entdeckung wohlmöglich eine „Achillesferse“ für viele Krebszellen. Bei weiteren Studien wurden drei Protein-Komplex-Anordnungen via RNAi untersucht, indem transgene BAC-Zelllinien (bakterielle artifizielle chromosomale Zelllinien) für alle Komplex-Komponenten generiert und deren Protein-Level als auch die Lokalisierung von interagierenden Proteinen untersucht wurden. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass sich bei Ausschaltung anderer Komplex-Komponenten die gemessenen Proteinwerte in der Zelle reduzieren und somit eine Instabilität des kompletten Proteinkomplexes hervorgerufen wird. Dieses Resultat wird es höchstwahrscheinlich nicht nur künftig erlauben, globale Protein-Level-Abhängigkeiten zu messen, sondern auch Proteine eines Komplexes gezielt zu regulieren. Ferner wurde HOT1 als neues direkt Telomer-bindendes Protein in Wirbeltieren identifiziert. Mit Depletions- und Überexpressions-Experimenten (Entfernung von Zellsubstanzen bzw. erhöhte Anreicherung) konnte HOT1 als positiver Längenregulator von Telomeren klassifiziert und eine Interaktion mit dem aktiven Telomerase-Komplex nachgewiesen werden. Da Telomerlängen in Abhängigkeit mit dem Zellalterungsprozess und der Entwicklung von Krebs stehen, stellt die nachgewiesene positive funktionale Rolle von HOT1 ein signifikantes therapeutisches Target dar.
DiGtoP
Immuno-Fluoreszenz-Färbung von HOT1 (grün) an Chromosomen-Enden
der Maus-Pachytän-Chromosomen (rot) ist dargestellt.
DiGtoP
KTT
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